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ÿþVor dem Hintergrund einer früheren Studie [25], in der gezeigt wurde, puma basket platform patent dass ErbB4 mit Bcl-2 interagiert und dass EGFR / EGFRvIII und ErbB4 eine strukturelle Homologie aufweisen, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII mit den drei proapoptotischen Proteinen, die mit Bcl-2 koexprimieren, einen Komplex bildet Rezeptoren. Wie aus den Ergebnissen der Immunpräzipitation (IP) / Western-Blotting unter Verwendung eines EGFR-Antikörpers für IP (1c) hervorgeht, bildet EGFRvIII in GBM-Xenotransplantaten mit endogenem EGFRvIII (D-270 MG) einen Komplex mit PUMA, jedoch nicht mit Bax und Bmf und D-317 MG) und mit stabil transfiziertem EGFRvIII (U87MGEGFRvIII). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PUMA in drei EGFR-exprimierenden GBM-Zelllinien mit EGFR coimmunopräzipitiert (1d).

Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen puma basket platform white der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente puma basket rosa wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

U87MG-Vektor- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektantenzellen wurden 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin ausgesetzt und dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Die Erzeugung und Charakterisierung der isogenen Zelllinien wurde bereits beschrieben [9]. (D) Western Blot zeigt an, dass U87MG-Vektorzellen ein sehr geringes Maß an endogenem EGFR (höheres Molekulargewicht; 175 kD) exprimieren, während U87MG-EGFRvIII-Zellen eine signifikante EGFRvIII-Expression (140 kD) enthalten -Expression von EGFRvIII in U87MG-Zellen führte zu einer puma basket sale signifikanten Resistenz gegen Anisomycin-induzierte Apoptose (3c, d).

U87MG-EGFR- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektanten und T98G-GBM-Zellen mit endogenem EGFR wurden mit 1% DMSO und 1 & mgr; M Apoptose-induzierendem Staurosporin (ST) behandelt, geerntet und einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechts) unterzogen panel), wie bereits beschrieben. Es ist bekannt, dass sich PUMA auf den Mitochondrienmembranen befindet, um bei entsprechendem Stress eine Apoptose auszulösen [40; 41]. Begründet durch unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA gemeinsam exprimieren und interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII die subzelluläre PUMA-Lokalisierung regulieren könnte.

Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar von U87MG-EGFRvIII- und U87MG-Vektorzellen. Die Mitochondrienfraktionierung / Western-Blotting (5a) zeigte, dass PUMA in erster Linie in den nicht mitochondrialen Fraktionen von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter nicht belasteten Bedingungen lokalisiert war und sich nach Exposition gegenüber den apoptotischen Induktoren Staurosporin (ST) und einer moderaten mitochondrialen Translokalisierung unterzog Anisomycin (AN). Wie durch den niedrigen mtPUMA-Index (0-0,02) angezeigt, ist der Großteil puma basket satin von PUMA in den nicht mitochondrialen Fraktionen der EGFRvIII-exprimierenden U87MGEGFRvIII-Zellen sequestriert (5a).

In Kontroll-siRNA-behandelten natürlichen T98G-GBM-Zellen ist PUMA hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. In EGFR-spezifischen siRNA-behandelten Zellen beobachteten wir einen deutlichen Anstieg des mitochondrialen PUMA (linkes Feld). EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (rechtes Feld). Lamin B: Kernprotein. ME: mitochondriale Extrakte. NME: nicht mitochondriale Extrakte. (D) PUMA wird im Zytoplasma EGFR-exprimierender menschlicher Brustkrebszellen sequestriert. MDA-MB-468-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie hohe Mengen an endogenem EGFR exprimieren [34], wurden mit und ohne Staurosporin behandelt, in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert und Proteinextrakte wie zuvor beschrieben analysiert.

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